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2020年10月21日/医麦客新闻 eMedClub News/--疫苗接种通过降低传染病造成的死亡率和发病率，对全球健康和人类生活质量产生了巨大影响，其发展基于Louis Pasteur提出的经典3I模式——“分离、灭活和注射病原微生物”。
随着科学和技术的发展，疫苗的开发手段也发生了很大的变化。今年，新冠病毒席卷全球，“疫苗”这一关键词一时成为全民关注的焦点，各类创新技术也纷纷助力其开发。其中，基于信使RNA（mRNA）技术的新冠疫苗率先进入临床研究，使行业再一次感受到了这种现代疫苗开发的新技术路径的强大潜力。很多人或许是因为这次新冠疫情才关注到疫苗领域，并通常认为疫苗是用来预防（传染性）疾病的。但疫苗事实上可以是预防性的，也可以是治疗性的；治疗性疫苗是在已发病个体中，通过诱导特异性免疫应答，达到治疗疾病或防止疾病恶化的效果。疫苗大致可分为减毒活疫苗（减毒微生物），灭活疫苗（灭活微生物），亚单位疫苗（纯化抗原）或类毒素疫苗（灭活细菌毒素）。与注射减毒或灭活病原体的传统概念不同，现代疫苗方法，即亚单位疫苗，侧重于表现出与传统疫苗类似的功效，同时避免与全细胞疫苗相关的安全风险。然而，亚单位抗原往往表现出较低的免疫原性，这可以通过使用递送系统和/或免疫增强化合物作为佐剂来纠正，以增强免疫原性。与传统的基于全生物的疫苗方法相比，现代基于基因组的合理疫苗设计具有巨大的潜力。随着现代基因组技术的发展，为了进一步突破传统疫苗和亚单位疫苗的局限性，重组病毒载体疫苗（将编码病原体的亚单位基因整和进病毒载体（如腺病毒等）的基因组）和核酸疫苗（即DNA疫苗和mRNA疫苗，通过将编码疫苗的DNA或mRNA直接注射入人体，利用人体细胞产生疫苗，引起人体的免疫应答）也愈加受到关注。其中，基于核酸的疫苗为安全有效的生物制剂模拟基于活生物的疫苗接种铺平了道路，尤其是在刺激细胞免疫方面。这项技术在开发针对多种适应症和疾病的新型疫苗方面显示出广阔的潜力，其范围从传染病、癌症、自身免疫性疾病和超敏反应的预防到治疗。据2020年2月发布的市场数据预测，预计到2024年，全球疫苗市场将从2019年的417亿美元增至584亿美元，复合年增长率为7.0%。另外随着新冠疫情的持续，疫苗开发也将持续成为关注的焦点。▲全球疫苗/全球癌症疫苗市场
（图片数据来源：marketsandmarkets.com）
正如前面所提到的，疫苗可以是预防性的，也可以是治疗性的。肿瘤治疗药物目前是全球最大和增长最快的药物细分市场，近年来，疫苗开发也已经成为癌症这一重大疾病新治疗选择的一个热门研究方向，这一个性化策略也在2019年被《麻省理工科技评论》选为当年的“全球十大突破性技术”之一。相比全球疫苗市场，全球癌症疫苗市场规模增长更快，2019年为46亿美元，预计到2024年将达到101亿美元，复合年增长率为17.28%。
▲2019 年《麻省理工科技评论》全球十大突破性技术之一：“定制癌症疫苗”
而在过去的几年中，人们越来越关注使用mRNA作为一种新的预防和治疗方法。目前，基于mRNA的药物的临床努力主要是针对传染病疫苗、肿瘤免疫疗法、治疗性蛋白质替代疗法和遗传疾病治疗。mRNA疫苗在肿瘤免疫领域有着广阔的应用前景：迄今为止，已被广泛尝试应用于包括前列腺癌、急性骨髓白血病、转移黑色素瘤、肺癌等多种类型肿瘤的治疗研究。至今，新兴的mRNA疫苗领域的成果是令人兴奋的，大量相关的临床前数据已经产生，并且在过去十年中已经开始了一些临床试验，进一步推进了将mRNA疫苗转化为人类疾病预防和治疗应用的设想。▲ 部分正在进行临床试验的mRNA疫苗项目（图片来源：参考来源3）而一个领域的火热和前景，往往从资本的注入上最能体现。根据2020年4月27日Nature Reviews Drug Discovery的报道，在mRNA技术领域，自2015年以来，三家具有代表性的mRNA治疗公司（Moderna Therapeutics、BioNtech和CureVac）吸引了28亿美元的私人投资。此外这三家公司目前都已经在纳斯达克上市。➤ 2018年12月，mRNA疗法新锐Moderna Therapeutics以6亿美元的募资总额，成为了当时生物技术行业史上最大的IPO融资案例，估值约为76亿美元。➤ 2019年7月，作为第一家将mRNA个性化肿瘤疫苗引入临床的公司，德国BioNTech宣布完成3.25亿美元的B轮融资。这是欧洲生物技术公司有史以来最大规模的融资之一。从全球来看，这是当时完成的规模最大的私人融资。2019年10月，BioNTech正式登陆纳斯达克上市。➤ 2020年8月14日，CureVac登陆纳斯达克，IPO募资约2亿美元。该公司IPO首日股价涨250%，市值98.6亿美元。这三家生物技术公司也是此次新冠mRNA疫苗研发的主力军，相关候选产品率先进入临床开发取得了亮眼的成绩。日前，辉瑞和BioNTech合作开发的新冠mRNA疫苗BNT162b2先后向欧洲药品管理局（EMA）和加拿大卫生部提交了滚动申请，Moderna公司的新冠候选疫苗mRNA-1273也开始向加拿大卫生部提交滚动申请。mRNA疫苗正式步入上市轨道。WHO：正在开发的新冠mRNA疫苗（截止2020年10月15日）虽然基于核酸的疫苗在安全性、有效性、B细胞和T细胞反应的诱导以及特异性方面比传统疫苗具有显著的优势，但值得注意的是，mRNA疫苗与基于其他类型核酸的疫苗相比具有优势。DNA疫苗旨在将编码病原体抗原蛋白的基因整合进质粒中，在酵母或其他细胞内扩增培养，而后提取纯化得到含目标抗原的重组DNA质粒。这类疫苗的合成工艺简单，并且质粒DNA在室温下比较稳定的特点为其可及性增加了优势。与DNA疫苗相关的技术挑战是确保递送到细胞核中，在细胞核输出和在细胞质中翻译成蛋白质之前，抗原转录在细胞核中发生。另外，DNA疫苗存在整合到宿主基因组的潜在风险，可能导致插入突变。mRNA疫苗由编码疾病特异性抗原的mRNA链组成。一旦疫苗中的mRNA链进入人体细胞内部，细胞就会利用遗传信息产生抗原。然后将该抗原显示在细胞表面上，在此被免疫系统识别。相比传统疫苗，mRNA疫苗通过体外转录（IVT）合成，在开发和生产周期上有着明显的优势，成为对抗大规模爆发性传染病的新希望。
▲ mRNA疫苗的作用机制（图片来源：参考来源3）
两类mRNA，即非复制性mRNA（non-replicating mRNA）和自我扩增mRNA（self-amplifying mRNA），通常用作疫苗载体。非复制性mRNA仅编码目的蛋白抗原，而自我扩增mRNA也编码使RNA复制的蛋白。基于自我扩增mRNA的疫苗编码单链RNA病毒（例如，甲病毒、黄病毒或小核糖核酸病毒）的RNA基因组。对它们进行了工程改造，以增加表达的持续时间和水平，以及由编码抗原诱导的后续免疫反应。在单轮复制后，它们有效扩增了编码目标抗原的亚基因组mRNA的产生。自扩增mRNA和非复制性mRNA均可用于传染病的预防性疫苗，而非复制性mRNA可用于癌症疫苗。与DNA疫苗相比，mRNA疫苗仅针对细胞质传递，从而规避了基因组整合的风险。相对短的半衰期导致编码抗原的瞬时表达和更可控的表达。此外，mRNA可以在无细胞环境中通过体外转录（IVT）产生，从而避免使用微生物或培养细胞进行生产，并避免了生产中相关的质量和安全性问题。这允许简单的下游纯化以及快速和经济的制造。总的来说，相对于传统方法，mRNA疫苗的优势主要在于：➤ 安全性：mRNA疫苗不是由病原体颗粒或灭活病原体制成的，因此是非传染性的。RNA不会与宿主基因组结合，一旦蛋白质合成，疫苗中的RNA链就会降解。➤ 有效性：早期临床试验结果表明，这些疫苗可产生可靠的免疫反应，健康人群耐受性好，副作用少。➤ 生产：在实验室中，这类疫苗可以更快地生产出来，生产过程可以标准化，从而提高对新爆发疫情的反应能力。目前，制造mRNA疫苗的方法可能非常有效，但是，要确保这些疫苗适当发挥作用，还需要克服一些技术挑战：➤ 非预期效应：疫苗中的mRNA链可能引起意外的免疫反应。为了使这种情况最小化，将mRNA疫苗序列设计为模拟哺乳动物细胞产生的序列。➤ 递送系统：mRNA是一个非常大的分子且不稳定、易降解。为了帮助实现递送，将RNA链掺入更大的分子中以助其稳定和/或包装成颗粒或脂质体，但目前mRNA有效地胞内递送仍是一个主要障碍。➤ 储存：如常规疫苗一样，许多mRNA疫苗需要冷冻或冷藏。目前正在进行的工作也致力于生产无需冷链储存的疫苗，因为这些疫苗将更适合在冷藏设施有限或没有冷藏设施的国家使用。毫无疑问，mRNA疫苗已经成为一个炙手可热的领域，新冠疫情更是一定程度上进一步催发了这一领域的研发进程。
虽然目前尚未有批准上市的基于mRNA的疗法，但基于其广阔的前景，越来越多的企业投身于这一领域的开发，力争成为领头羊。除上述三家mRNA技术巨头企业外，赛诺菲(Sanofi)和Translate Bio、本导基因、斯微生物、康希诺生物和加拿大Precision NanoSystems（PNI）公司、Elicio Therapeutics都在致力开发mRNA疫苗技术，用于癌症治疗或应对目前的新冠疫情。
而一个高效的mRNA疫苗需要：最佳的mRNA稳定性和细胞摄取；靶细胞如抗原提呈细胞（APCs）的细胞质传递和mRNA表达；能够诱导人体所需保护性的适应性免疫应答。mRNA疫苗开发过程的第一步是靶点抗原的筛选与发现，选择特异性的靶点对于mRNA疫苗开发至关重要。选择合适靶点后，需要小规模或批量合成靶点mRNA，同时需要对mRNA进行修饰以增强mRNA稳定性及其蛋白翻译能力，这一通过体外转录获取mRNA的过程还包括多个纯化步骤。接着，由于mRNA自身稳定性差，直接进入体内会被降解，因此高效的mRNA递送是疫苗发挥药效的保证；而与安全性和有效性有关的分析方法则是其开发是否成功的关键指标。针对mRNA疫苗研发，全球科学服务领导者Thermo Fisher Scientific（赛默飞世尔科技）提供从靶点筛选与发现、mRNA的生产、纯化、高效递送到分析方法建立的完整解决方案，帮助客户应对研发路径上的各项关键技术挑战，提升mRNA疫苗的有效性与安全性。▲ mRNA疫苗研究，赛默飞助力应对各项关键技术挑战
靶点筛选与发现：为筛选出合适的靶点，需对组织材料进行基因组分析和蛋白组分析，利用基因深度测序技术及蛋白质质谱分析技术来预测、识别和选择合适靶点。赛默飞可提供一系列创新型研究工具，覆盖核酸提取、反转录、PCR、二代测序文库制备、蛋白质质谱分析等，助您快速高效的进行靶点的筛选和发现。 mRNA的生产：随着mRNA疗法的加速发展，常规的、研究级的体外转录试剂已不能完全满足需求，需要按照更高质量标准专门设计和生产的原材料。除了可提供常规研究级的体外转录试剂，赛默飞还可提供专用于mRNA疗法的TheraPure试剂，其具有超高纯度且不含动物源成分，适用于工业级规模化生产。mRNA的纯化：通过体外转录获取mRNA包括多个纯化步骤。传统的酚氯仿或离心柱法纯化容量有限，且不适合用于自动化。基于磁珠的纯化技术更为灵活，体系可扩展且适合用于自动化。基于Invitrogen Dynabeads MyOne Carboxylic acid 和特有结合缓冲液的纯化方法可实现更高的mRNA回收率。
mRNA的递送：递送方式主要包括：（1）利用载体将mRNA注入体内，常用载体包括包括脂质体和DC细胞；（2）可以通过体内转染试剂直接将mRNA注入体内；（3）通过物理递送方法直接穿透细胞膜，将mRNA注入细胞内。赛默飞拥有体外递送转染策略：Lipofectamine MessengerMAX试剂和Neon电穿孔转染系统，以及突破性的体内递送转染试剂Invivofectamine 3.0 试剂。分析方法建立：mRNA疫苗和其他疫苗一样，安全性和有效性是其开发是否成功的关键指标。疫苗进入体内后的吸收分布，引起的免疫原性和毒性，以及疫苗的功能性等，均是检验安全性和有效性的重要方法。相信基于行业各领域的赋能与创新，基于mRNA的疫苗无论是在针对新冠，还是在针对癌症等其他疾病的治疗应用上，都将进一步发挥其强大潜能。参考来源：
1.https://www.nature.com/articles/d41573-020-00078-0
2.https://www.phgfoundation.org/briefing/rna-vaccines
3.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7076378/
4.https://www.marketsandmarkets.com/Market-Reports/vaccine-technologies-market-1155.html
5.https://www.marketdataforecast.com/market-reports/cancer-vaccines-market
6.WHO官网
7.https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/products-and-services/promotions/mRNAvaccinesresearch-cn.html#invitrogenall
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